作业帮如何使用Folin-酚法测定蛋白酶的活力?
来源：学生作业帮 编辑：拍题作业网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/04/29 14:23:59
如何使用Folin-酚法测定蛋白酶的活力?
实验原理：
采用Folin-酚法测定,Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成.甲试剂由碳酸钠,氢氧化钠,硫酸铜及酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）组成.多肽中的肽键在碱性条件下,与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成紫红色络合物.乙试剂是由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴等组成.此试剂在碱性条件下,易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应,其色泽深浅与多肽含量成正比[28].
实验所需试剂的配置：
(1) 试剂甲：(A) ：10g Na2CO3,2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）,溶解于500mL去离子水.(B) ：0.5g 硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100mL 去离子水中；将50份（A）与1份（B）混合,即为试剂甲.
(2) 试剂乙：将Folin-酚试剂与去离子水按1:1混合.
(3) 标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白,溶于去离子水中,浓度为250μg/mL左右.牛血清蛋白溶于水,若混浊,可改用0.9%（质量分数）NaCl溶液.
(4) 样品溶液：通常根据样品中蛋白含量的不同,样品在测定前需要进行适当倍数的稀释.
实验步骤：
(1) 标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3只留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL标准蛋白质溶液（浓度为250μg/mL）.用水补足到1.0 mL,然后每支试管加入5mL试剂甲,在漩涡混合器上迅速混合,于室温（20-25℃）放置10 min.再向各个试管加入0.5mL试剂乙,同样立即混合.然后在室温下放置30 min,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各试管中溶液的吸光度值,以蛋白质的量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制出标准曲线.
(2) 样品的测定：取1mL 样品溶液（其中蛋白质含量约20-25μg）,按上述方法进行操作,取1mL水代替样品作为空白对照.
采用Folin-酚法测定,Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成.甲试剂由碳酸钠,氢氧化钠,硫酸铜及酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）组成.多肽中的肽键在碱性条件下,与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成紫红色络合物.乙试剂是由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴等组成.此试剂在碱性条件下,易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应,其色泽深浅与多肽含量成正比[28].
实验所需试剂的配置：
(1) 试剂甲：(A) ：10g Na2CO3,2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）,溶解于500mL去离子水.(B) ：0.5g 硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100mL 去离子水中；将50份（A）与1份（B）混合,即为试剂甲.
(2) 试剂乙：将Folin-酚试剂与去离子水按1:1混合.
(3) 标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白,溶于去离子水中,浓度为250μg/mL左右.牛血清蛋白溶于水,若混浊,可改用0.9%（质量分数）NaCl溶液.
(4) 样品溶液：通常根据样品中蛋白含量的不同,样品在测定前需要进行适当倍数的稀释.
实验步骤：
(1) 标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3只留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL标准蛋白质溶液（浓度为250μg/mL）.用水补足到1.0 mL,然后每支试管加入5mL试剂甲,在漩涡混合器上迅速混合,于室温（20-25℃）放置10 min.再向各个试管加入0.5mL试剂乙,同样立即混合.然后在室温下放置30 min,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各试管中溶液的吸光度值,以蛋白质的量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制出标准曲线.
(2) 样品的测定：取1mL 样品溶液（其中蛋白质含量约20-25μg）,按上述方法进行操作,取1mL水代替样品作为空白对照.
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