已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!
来源:学生作业帮 编辑:拍题作业网作业帮 分类:生物作业 时间:2024/04/30 22:05:58
已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!
我目的片段大小为2800,载体为eGFP-N1,设计引物中,我是取了ATG开始的前20个左右的碱基,加入酶切位点和保护碱基,后面是取了去掉终止密码子的互补序列,加入酶切位点和保护碱基……(问题:1、除了酶切位点和保护碱基,还有什么需加入什么吗?2、需要在上游序列中加入KOZAK序列吗?其作用是什么?下游也需要吗?3、酶切位点的保护碱基是特定的吗?4、克隆目的基因,必须从ATG开始设计上游引物,终止密码子设计下游引物吗?可不可以从中间或者两侧设计?因为位置若固定的话很难找到合适的引物)……十分紧急,
我目的片段大小为2800,载体为eGFP-N1,设计引物中,我是取了ATG开始的前20个左右的碱基,加入酶切位点和保护碱基,后面是取了去掉终止密码子的互补序列,加入酶切位点和保护碱基……(问题:1、除了酶切位点和保护碱基,还有什么需加入什么吗?2、需要在上游序列中加入KOZAK序列吗?其作用是什么?下游也需要吗?3、酶切位点的保护碱基是特定的吗?4、克隆目的基因,必须从ATG开始设计上游引物,终止密码子设计下游引物吗?可不可以从中间或者两侧设计?因为位置若固定的话很难找到合适的引物)……十分紧急,
1.首先这应该是个融合表达载体.应该考虑后面的读码框问题.就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基.使得你的目的基因和egfp在同一读码框内.
2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后期的实验目的了.不过不加的话应该只是效果没有加了好,而不是没有效果.下游当然不用加.
3.NEB公司的网站上有特定酶的保护碱基图表.他们应该都是进行过研讨的,所以建议您参考这个.
4.克隆目的基因当然要保证从ATG开始.到终止码结束.这样叫一个完整的CDS区,表达一个完整的功能蛋白.不可以小于这个范围,但是多出来也许可以吧.就是从两侧的UTR区开始设计.但是我不敢保证啊.所以我建议您先在UTR区设计引物,扩出来长片段后再扩增您的目的片段.这样会容易点.
P.S.保护碱基的作用是可以使PCR产物两端的酶切位点被识别,从而可以直接酶切PCR产物使其产生粘性末端,以便进行后续的克隆.这和PCR能否扩增出来没有任何关系.
2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后期的实验目的了.不过不加的话应该只是效果没有加了好,而不是没有效果.下游当然不用加.
3.NEB公司的网站上有特定酶的保护碱基图表.他们应该都是进行过研讨的,所以建议您参考这个.
4.克隆目的基因当然要保证从ATG开始.到终止码结束.这样叫一个完整的CDS区,表达一个完整的功能蛋白.不可以小于这个范围,但是多出来也许可以吧.就是从两侧的UTR区开始设计.但是我不敢保证啊.所以我建议您先在UTR区设计引物,扩出来长片段后再扩增您的目的片段.这样会容易点.
P.S.保护碱基的作用是可以使PCR产物两端的酶切位点被识别,从而可以直接酶切PCR产物使其产生粘性末端,以便进行后续的克隆.这和PCR能否扩增出来没有任何关系.
已知一个基因的mRNA和cDNA,我想克隆此基因,进行转染表达,但是设计的引物无法扩增出目的片段……急求!
以真核基因mRNA设计引物扩增出的是什么?是DNA还是mRNA?
关于引物和目的基因的关系.针对某基因设计的同一对引物在不同人的基因组中扩增的片段一定一样吗
应用Oligo (dT) 作为引物,合成的cDNA含有目的基因和内参基因吗?或者,获得的cDNA 是不是扩增的总RNA
我想扩增一段目的基因,只知道一个CDS,ATG开始TAA结束的,后续要表达蛋白,怎么设计引物啊?
我想问根据同一个基因设计的两个引物,都在小麦中扩增,扩增片段大小是否一样?
请问您一个基因的全长已经克隆出来,怎样进行验证呢?从ATG和TGA设引物重新扩增,还是从非编区设引物呢
我提取RNA,反转录得到cDNA,我要由此扩增功能基因,请问引物设计时,用查到的mRNA序列,还是用cDNA序列
针对mRNA上的某个基因设计逆转录PCR的引物,逆转录时得到的cDNA只是这个基因的cDNA吗?
已知目的基因全长,如何设计引物克隆全长
PCR 引物设计,在扩增一个基因片段,1200bp左右,编码区1000个bp左右.由于上游引物GC含量高,我想分两段扩增
我想扩增某一目的基因,请问引物一定要在起始密码子和终止密码子周围设计吗?