为什么用限制酶1切质粒,限制酶2切目的基因?一直不懂啊~质粒不是应该切个口就好了吗?

来源：学生作业帮编辑：拍题作业网作业帮分类：生物作业时间：2024/04/30 20:32:42

1楼,你也太科普了吧.
楼主,是这样的,这个题目的条件有点不全,但是我们可以得到这样的信息：
把识别GGATCC的酶叫做E1,把识别GATC的酶叫E2,那么：
1）E2也可以识别E1的酶切序列（都有GATC）
2）E2切下来漏出的末端可能可以与E1匹配,也可能不行,这取决两种假设：a如果两个酶切后留下的都是粘性末端,而且露出的末端都是GATC,那么根据碱基互补配对原则E1切下后露出的末端也可以与E2切下的末端互补,最终发生DNA的链接（在T4 ligase作用下）
b 如果两个酶切留下的都是平端,那么平端对平端也可以发生链接（也是在T4 ligase作用下）,这是我们实验中将不同酶切片段连接起来的一种方法,事实上,比如两个酶切后留下的都不是相互互补的末端,但是我们使用Klenow大片段酶作用依然可以将末端补平,这样还是可以连接
除了ab两种假设外,E2切下的片段将不能和E1切口发生互补连接.
这个质粒构建的方法就是建立在E2切下的末端可以与E1切下的粘性末端互补这一假设上,
如果质粒用E2切的话,那么质粒会被切成两端,作为一个质粒来讲,丢失任何一个那么大的片段（从图上看差不多有一半了）都会产生不完整的质粒而且无法再细菌里复制,而且用E2切后质粒将同时丧失氨苄和四环素两种抗性,不便于后期转化后筛选,所以不能选用E2或者E2+E1双酶切
对于你要做的片段而言,它就不存在这个问题,用E1+E2切后将露出相同的GATC粘性末端,而质粒用E1切后变成一个线性质粒没有丧失任何元件,但是露出了GATC末端（两端都是,这个你可以理解吧）.那么片段和质粒都有相同的粘性末端,在T4连接酶作用下是非常容易发生连接的.只不过有两种连接方向（这个你也可以理解吧.）
而且这个设计巧妙之处在于,插入目的片段后,四环素的基因被破坏了（你在四环素里插了那么大的片段,基因很可能非正常转录或翻译）,因此质粒将不具有编码四环素抗性蛋白,那么转化入成功插入目的片段的工程菌将不具有四环素抗性而只具有氨苄抗性.
如有不明白可以跟我再补充或直接站内信联系
再问：谢谢你啊，太辛苦了！~！~！可不可以这么说：用酶2切目的基因，就会使目的基因多了许多，然后自己找合适的与质粒重组~ 为什么要使质粒不具有四环素抗性蛋白，是便于筛选吗？那如果有四环素抗性蛋白，不是也可以在筛选的培养基中加入四环素来选择吗？
再答：不是便于筛选，而是便于验证。。就是插入失活的质粒应该不具有四环素抗性，那么带有这个质粒的菌株应该也不具有，只是再次做个验证而已:)

为什么用限制酶1切质粒,限制酶2切目的基因?一直不懂啊~质粒不是应该切个口就好了吗? 基因工程中,为什么切质粒和切目的基因要用同种限制酶? 剪切目的基因所用的限制酶与切割质粒所用限制酶一定要相同吗用同种限制酶切质粒和含有目的基因的DNA,用DNA连接酶连接后为什么不会出现载体-目的基因连接物这种产物? 为何用相同限制酶切割目的基因和质粒其实是概念性的问题目的基因不是经过限制酶切割后才有的吗?目的基因与质粒重组中有个步骤是：用同种限制酶切割目的基因...这 “基因工程中切割目的基因和质粒的限制酶可以不同.”为什么? 用同种限制酶切质粒和目的基因DNA,连接后,产生的载体-载体连接物不是也有标记基因而且在培养基上生长吗关于基因表达载体基因表达载体,不是用限制酶切开质粒,然后插入目的基因吗?那么,为什么又要有启动子来启动转录出mRNA?要目的基因和质粒为什么要用一种限制酶切割?限制酶和DNA连接酶作用的位点相同么? 基因工程中用限制酶切割质粒和目的基因用一种限制酶和两种限制酶是否都可以?各有何优缺点? 当使用限制酶来获取目的基因时是否一定要用同种限制酶切割DNA和质粒来获取目的基因