蛋白质及氨基酸的测定有哪些方法?

蛋白质及氨基酸的测定有哪些方法?

楼主你好： 测定蛋白质最基本的方法是定氮法,即先测定样品中的总氮量,再由总氮量计算出样品中蛋白质的含量.蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法,它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一,在国内外应用普遍.此外,双缩脉法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定,由于方法简便快速,故多用于生产单位质量控制分析. 蛋白质及氨基酸的测定 蛋白质是生命的物质基础,是构成生物体细胞组织的重要成分,一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质.人体内的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及转运都与蛋白质有关.人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物,来构成自身的蛋白质,故蛋白质是人体重要的营养物质,也是食品中重要的营养指标. 蛋白质是复杂的含氮有机化合物,分子量很大,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来,并具有一定的空间结构.不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同,故各种不同的蛋白质其含氮量也不同.蛋白质可以被酶、酸或碱水解,最终产物为氨基酸.氨基酸是构成蛋白质的最基本物质,在构成蛋白质的氨基酸中,亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成,必须依靠食品供给,故被称为必需氨基酸,它们对人体有着极其重要的生理功能,常会因其在体内缺乏而导致患病,或通过补充而增强了新陈代谢作用.所以食品及其原料中蛋白质和氨基酸的分离、鉴定和定量具有极其重要的意义. 蛋白质的测定 测定蛋白质最基本的方法是定氮法,即先测定样品中的总氮量,再由总氮量计算出样品中蛋白质的含量.蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法,它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一,在国内外应用普遍.此外,双缩脉法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定,由于方法简便快速,故多用于生产单位质量控制分析. 微量凯氏定氮法 本法适用于各类食品中蛋白质的测定. 1．原理 食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺.然后碱化蒸馏使氨游离,用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量.反应过程分为三个阶段,用反应式表示如下. ①消化 2NH2(CH2)2COOH 4-13H2S04一(NH.)2S04+6C02+12S0=+16H20 (NH4)2S04+2Na()H一2NH3十+2H20+.Na2S04 2NH3+4H3803—,(NH4)2 B207+5H20 ③滴定 (NH4)2 B2 07+2HCl+5H20—NH4C1+4H3803 2．仪器 ①消化炉. ②凯氏定氮蒸馏装置. 3．试剂 所用试剂均用不含氨的蒸馏水配制.试剂均为分析纯. ①CuS04. ②K2SO. ③浓H2SO. ④2％H.BO.溶液. ⑤混合指示剂：1份O．1％甲基红乙醇溶液与5份O．1％溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合.也可用2份O．1％甲基红乙醇溶液与1份0．1％次甲基蓝乙醇溶液临用时混合. ⑥饱和氢氧化钠：500 g氢氧化钠加入500 mL水中,搅拌溶解,冷却后放置数日,澄清后使用. ⑦0．01 toolI．一’或0．05 toolL叫HCl标准溶液(需用无水碳酸钠标定后使用). 4．操作步骤 ①样品消化：精密称取O．2～2．0 g固体样品或2～5 g半固体样品或吸取液体样品5～20mI.,放人500 mI.干燥凯氏烧瓶中,加人O．2 g硫酸铜、3 g硫酸钾及20 mL浓HzSOa,于凯氏瓶口放一小漏斗,并将其以45.角斜支于有小孔的石棉网上.（更多详细咨询请参考国家标准物质网 www.rmhot.com ）用电炉以小火加热,待内容物全部碳化,泡沫停止产生后,加大火力,保持瓶内液体微沸,至液体变蓝绿色透明后再继续加热微沸30 min.冷却,小心加入20 mL水,再放冷至室温,移人100 mL容量瓶中,并用少量水洗烧瓶洗液并人容量瓶,在加水至刻度,混匀备用.除不加样品外,取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸,按同一方法做试剂空白消化. ②水蒸气发生瓶内装水至约2／3处,加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水. ③向接收瓶内加入10 mL 2％硼酸溶液及混合指示液l滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取lO mI.样品消化稀释液由小玻璃杯流人反应室,并以10 mL水洗涤小烧杯使之流人反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞.将3～10 mL饱和氢氧化钠溶液倒人小玻璃杯中,提起玻璃塞使其缓缓流入反应室,立即将玻璃塞盖紧,并加水于小玻璃杯中以防漏气.加紧螺旋夹,开始蒸馏.蒸汽通人反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏2～5 min,移动接收瓶,使冷凝管下端离开液面,然后用少量中性水冲洗冷疑管下端外部,再蒸馏1 min取下接收瓶,以0．01 molI．叫或O．05 molL1HCl标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点.同时吸取10 mI_,试剂空白消化液按③操作. 5．计算 6.说明 ①干样用称量纸称重连纸一同消化,空白管同样放称量纸消化. ②含糖量高和油脂高的样品消化时容易溢出,加热要缓慢. ③氨是否蒸馏完全,可用pH试纸测试馏出液是否为碱性来判断. ④实验前必须仔细检查蒸馏装置的各个连接处,保证不漏气.所用橡皮管、塞子须浸在氢氧化钠(10％)中,煮沸10 min,然后水洗、水煮,再用水洗. ⑤小心加样,切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部和颈部.