请问,荧光定量PCR的两个曲线感觉都是正常的,怎么跑SDS-page胶却出现双带呢?而荧光曲线不正常跑胶却正常

来源：学生作业帮编辑：拍题作业网作业帮分类：生物作业时间：2024/04/29 21:27:21

请问,荧光定量PCR的两个曲线感觉都是正常的,怎么跑SDS-page胶却出现双带呢?而荧光曲线不正常跑胶却正常
我用Trizol和氯仿手提人血清miRNA先反转,然后做Realtime PCR..然后跑2%的DNA胶.目的DNA长度大概是20~50bp.有什么可能的原因吗?

一楼没有做过 miRNA,先不要理他.
楼主的做法我并没有做过,因为我使用的是Tagman试剂盒带有特异性探针,所以并无特异性问题.
我理解楼主的意思是：
1505及1489曲线不正常,1505条带正常,1489条带不正常
659与1491曲线正常,但是两个条带都不正常
我的意见如下：
1.楼主的引物是自己设计的吗?目标只有二十多碱基,哪里来的特异性?
2.楼主的反转用的什么引物?
3.楼主的样本是否含有DNA?有检查过DNA消化干净了吗?
再问：这是我理解老师的解释，画的一张关于反转引物的示意图，参考指正。

再答：童鞋，你画的图看起来跟我现在使用的Stem loop PCR相似，我估计是因为绿色部分序列可以人工设计成为不存在于基因组的缘故，我发现我的大部分PCR引物对对DNA不敏感，只有一个引物对能够扩增DNA样本。所以你的问题确实可能同DNA污染无关。至于检查DNA存在的办法，顺便说一句就是最基本的PCR，RNA样本不经反转录，直接使用识别基因组DNA的引物对PCR，阳性则有DNA，阴性则干净。说回你的问题，根据我的理解，stem loop PCR一个很大的隐患就是，反转引物可能成为PCR扩增的模板，这个非特异性因素在此处是无法消除的，而反转引物与特异性的cDNA模板根本一大部分序列相同好不好？所以我的RT-PCR试剂盒特别强调限制反转产物进入PCR反应的用量。而反转引物与真正模板的细微差别，或许可以解释你得到的melting性质无法区分但大小可以区分的两个条带。如果问题是在此，则需要优化： 1。反转效率--最大程度地从真miRNA得到cDNA模板，消耗反转引物 2。反转引物用量 3。cDNA产物在PCR中的用量

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