作业帮获得诺贝尔物理学奖科学家的共性
来源：学生作业帮 编辑：拍题作业网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/04/27 23:27:11
获得诺贝尔物理学奖科学家的共性
一篇小论文,距开学还有2天,
一篇小论文,距开学还有2天,
化学:10月4日当地时间上午11时45分(北京时间17时45分),瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将2006年度诺贝尔化学奖授予美国科学家科恩伯格,以表彰他对真核转录的分子基础所作的研究
物理:10月3日当地时间上午上午11时45分(北京时间17时45分),瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将2006年度诺贝尔物理学奖授予两名美国科学家约翰-马瑟和乔治-斯莫特,以表彰他们发现了黑体形态和宇宙微波背景辐射的扰动现象
生理学或医学奖2006年诺贝尔生理学或医学奖授予了两名美国科学家安德鲁.法尔和克雷格.梅洛,以表彰他们发现了RNA干扰现象.
化学 真核转录的分子基础
1 引言
瑞典皇家科学院10月4日宣布,美国斯坦福大学医学院教授罗杰?科恩伯格Roger D. Kornberg因在“真核转录的分子基础”研究领域所作出的杰出贡献,而独自获得2006年度诺贝尔化学奖[1-3].
Roger D. Kornberg现年59岁,1947年出生于美国密苏里州圣路易市,在斯坦福大学获得博士学位,目前供职于该大学医学院.其父Arthur Kornberg因致力于DNA复制的研究,是1959年的诺贝尔医学或生理学奖得主之一[3].老Kornberg获奖原因是因为破解基因信息是如何从一个DNA复制到另一个DNA的,而小Kornberg则是在遗传信息如何从DNA转录到mRNA的过程中做出了卓越贡献.
DNA分子由G, C, A和T 4个不同的碱基组成.RNA同样由G, C,A和U 4个相对应的碱基组成.这4个不同的碱基排列组合即构成了遗传信息.DNA分子为一个双链螺旋,两链间可形成G, C配对和A,T配对（Watson, Crick 和 Wilkins 因此获得1962年的诺贝尔生理学或医学奖）,这保证了遗传信息的可靠储存[2].
转录即存储于DNA中的遗传信息在RNA聚合酶作用下被激活并拷贝到互补的mRNA链上.最终mRNA上的遗传信息由核糖体翻译成有功能的蛋白质.转录是生命活动中最中心的过程之一,有着复杂的调节机制.Kornberg正是在真核细胞的转录及其调节的分子机制中做出了突破性的贡献.他将结构生物学与生化技术相结合,从而得以在酵母中分离出高纯度的RNA聚合酶及其与模版DNA、mRNA、核苷酸底物、调节蛋白结合的功能相关复合物.
Kornberg主要贡献是其创造性地制作了详细的晶体结构图片,用于描述真核细胞中转录过程的整个机制.我们可以看到新的RNA链如何逐渐生成,以及转录过程中必不可少的其它若干分子的作用.由于这些图片可以清楚地区分不同的原子,从而使转录过程和转录调节机制的理解成为可能[2].
2 研究背景
真核转录研究始于50年前,Weiss和Gladstone[4]于1959在大鼠肝脏细胞核中发现了RNA聚合酶的活性.这一发现使转录研究成为生命进程中一个至关重要的研究领域.但是从大鼠肝脏细胞核中提取RNA聚合酶极为困难,而从细菌中纯化酶则相对简单得多.因此,原核转录研究率先开展起来,1965年诺贝尔生理学或医学奖即颁给了Jacob, Monod和Lwoff,以表彰他们在细菌基因表达的转录调节中所作出的贡献.
很长一段时间以来,人们认为在所有细胞中的基因结构和转录机制与细菌中的是相同的.后来才得知真核细胞中,例如酵母和人类,染色体DNA需要与蛋白质结合,包装成核小体,这种高度压缩的染色质形式在细菌中是没有的.真核转录机制比原核要复杂得多.所以,了解真核细胞中RNA聚合酶的作用和调节机制对于解析转录调节以及细胞中基因表达的调控至关重要.
Roeder and Rutter[5]和Chambon[6]证实,真核细胞包含3种不同的RNA聚合酶(I-III).蛋白编码基因由RNA聚合酶II负责转录.真核RNA聚合酶由多个亚单位组成.细菌RNA聚合酶由4个亚单位和1个可变亚基Sigma组成[7].Sigma是聚合酶识别启动子和起始转录所必需的.启动子即DNA上的一段特殊序列,用于起始RNA的合成.对于启动子的研究最早始于原核细胞的转录,但真核的启动子比原核还要长.1981年Banerji 等[8]和Moreau等[9]鉴别了基因特异性元件“增强子”.但是真核细胞中没有Sigma因子.因此要研究真核转录机制,就需要建立依赖真核RNA聚合酶II的以外源DNA为模版的可在特异启动子下转录的细胞体系.
1979年Weil等[10]利用纯化的RNA聚合酶,在提取的人类组织培养细胞中以一个病毒启动子进行特异性的起始转录.1980年Matsui 等[11]通过生化分馏法揭示了RNA聚合酶II复合体中存在多个转录因子,即RNA聚合酶II通用转录因子（TFIIB, D, E, F和H）.RNA聚合酶II在这5个通用转录因子的协助下识别基因起始位点,分离DNA模版链,对一条链进行转录生成mRNA.
3 2006年诺贝尔化学奖研究成果简介
3.1 体外酵母细胞转录体系的建立
Roger Kornberg 致力于转录领域的研究始于他在英国剑桥大学做博士后的时候.X-射线衍射证实,染色质是由大约10nm的重复亚基所组成.1973年Hewish和Burgoyne[12]用核酸酶处理染色质得到许多大小相同的断裂产物.Kornberg和Thomas 在1974年[13]发现组蛋白H3和H4在溶液中形成(H3)2(H4)2的四聚体.同年Kornberg[14]提出染色质的基本单位,即核小体是由1个组蛋白八聚体和200bp（碱基对）长的DNA所组成.
Kornberg回到斯坦福大学以后仍致力于真核生物的转录调节研究.他的重大贡献之一即培育了新的体外酵母细胞转录体系[15,16],使利用啤酒酵母（saccharomyces cerevisiae）作为真核生物的研究模型成为可能.Kornberg实验室为此体系的建立花费了10年时间,其间许多实验室因为几年中没有任何进展而纷纷放弃.但是正是这个酵母细胞体系的建立,为Kornberg创造了合适的RNA聚合酶和通用转录因子,为其研究提供晶体、创造了条件.
3.2 酵母RNA聚合酶及转录复合物结构的描述
3.2.1 调节器的发现
包含纯化的RNA聚合酶II,5个通用转录因子TFIIB,E,F,H和TATA结合蛋白的体系只能维持基础转录,而对于基因特异性激活蛋白的转录则无能为力.对这一问题的研究导致了调节器的发现,并使真核转录的一些早期遗传数据得到很好的解释.调节器是由大约20个不同蛋白组成的多蛋白复合体[17-19],在从酵母到人类的所有真核生物中,调节器的作用是将正负信号从与DNA结合的特异基因转录因子传递给RNA聚合酶II及其通用转录因子（图2）,其中图2物质包含DNA、通用转录因子TBP,TFIIB,E,F和H、调节器、RNA聚合酶以及与增强子结合的特异性转录因子.在探索转录过程研究中调节器的发现是一个里程碑.
随着调节器被分离,真核基因调节和转录的基本组分已被建立,即通用转录因子、调节器和RNA聚合酶II.细菌中的转录抑制和激活是其直接与RNA聚合酶结合,从而影响与启动子的结合.真核中染色质和调节器在基因特异性转录因子与RNA聚合酶之间起作用,使得调节更加复杂化.
Asturias等在1999年[20]得到了RNA聚合酶II-调节器复合物的电镜图,此图显示调节器围绕聚合酶成月牙形.调节器包含大约20多肽,1MDa.近来有关功能的调节器头部分子的表达和纯化已有报道.此复合物只有7个亚基,分子量为223kDa[21].调节器头部分子与RNA聚合酶的相互作用需要通用转录因子TFIIF的参与.
3.2.2 酵母RNA聚合酶及转录复合物结构描述
早在10年前,X-射线结晶学已描述了TBP结合于TATA-box DNA,以及TFIIB,TBP和DNA三重复合物的结构[22-25].Kornberg则首先意识到所有真核转录元件的组装可能是以RNA聚合酶作为一个平台,但是酵母RNA聚合酶II的复杂性以及纯化复合物的少量和不稳定性成为晶体研究的瓶颈.Kornberg用电镜和X-射线结晶学相结合,依据自己20年来对蛋白表达纯化的研究经验和二维蛋白结晶的方法最终解决了这个问题[26].
关于建立体外酵母转录系统的研究,Kornberg在2001年取得突破性进展.他发表于Science的两篇文章[27,28]分别描述了 0.28nm溶液中含有10个亚基的酵母RNA聚合酶结构以及包含RNA聚合酶,模版DNA,RNA产物的转录复合物结构.在此结构中,两个大亚基位于中间核酸结合空穴的两边,许多小亚基在外围.空穴中可见一个α-螺旋与其中一个大亚基相连,此螺旋穿过形成磷酸二酯键和延伸RNA链的活性中心.在空穴中可清楚看到一条DNA链和正在合成的RNA链之间核苷酸的接合（图3）.
图3中白色为RNA聚合酶,绿色为连接螺旋,粉色为激活位点金属离子,蓝色为DNA螺旋,红色为新合成的RNA.
Kornberg实验室后续发表的文章中,详尽描述了RNA聚合酶与DNA、RNA、插入的核苷酸或其他蛋白结合的不同的功能复合物的晶体结构.建立了包括5个通用转录因子在内的转录起始复合物的模型[27],即5个通用转录因子直接与双链DNA启动子结合,而RNA聚合酶只能与解旋之后的DNA相结合,解旋即DNA模版旋转90°,使其可以进入聚合酶的活性位点空穴.
3.3 真核转录分子机制的阐明
大量的数据为转录过程的动态描述提供了前提条件.Kornberg创造性地从溶液中去除了一种必需的碱基,当RNA的合成到达缺失碱基需要插入的位点,其合成过程半途中断.这正描述了在RNA链3'末端与掺入的核苷酸形成磷酸二酯键之后以及DNA-RNA杂交链发生迁移之前的分子结构[28].若此复合物中引入核酸的结合位点空缺,即为DNA-RNA杂交链迁移后的阶段[29].然后Kornberg创建它们的分子晶体,并用X-射线衍射获得其晶体排列的分子图,计算机可进一步精确计算分子中原子的位置.虽然当今这种生物大分子结晶的方法已被广泛应用,但通常只是观察组装后的复合物或是单个的分子,而真正用它去捕捉一个化学反应的过程还是很困难的.Kornberg革命性的贡献即在于此,他最先创建了整个转录机制的全流程图,大致分为下面3个过程.
3.3.1 迁移
首先是迁移过程.图3中绿色表示的连接螺旋被认为在转录DNA-RNA杂交链的迁移过程中起到棘齿的作用[28,30].RNA聚合酶分子使DNA双链处于正确的位置并形成空穴,只有与DNA正确配对的碱基才能进入空穴参与RNA的合成.一旦新的碱基插入正确的位置,DNA链就会被连接螺旋驱动向前迁移.连接螺旋末端的两个残基在苏氨酸-831和丙氨酸-832激活中心的下面,连接杂交链底部的碱基.由于聚合酶形状持续自发地变化从而导致了弹簧式的结构.连接螺旋的摆动会使DNA-RNA杂交链迁移0.3nm或一个核苷酸的距离.DNA链在新的碱基结合到延伸的RNA链之后,就以这种方式一次次地迁移到正确的位置[2].
3.3.2 RNA链与DNA链分离
其次是分离过程.迁移后阶段的结构图显示了聚合酶上的盖状环是如何将新合成的RNA链在位点-8与模版DNA分离,从而在-9和-10位将双链彻底分开的.最后添加在RNA上的核酸为位点-1.盖状环与另两个蛋白环一起阻止DNA与RNA链的重新结合[29].
3.3.3 核酸的选择
最后是核酸筛选过程.核苷酸通过漏斗样的结构被筛选运输到RNA聚合酶的活性中心.在迁移后阶段转录复合物与核苷酸和DNA在位点+1结合,同时还有很多核苷酸不与其结合,故在酶的激活位点核苷酸是如何被筛选的也是一个很有趣的问题[31].筛选过程又可分为两步,首先核苷酸反向结合到位于活性位点下面的进入位点.此结合将大大延长核苷酸在激活位点区域的寿命[32].然后核苷酸发生逆转进入活性位点,从而有选择性地与 DNA模版相结合.若引入的碱基与模版匹配,则在两个金属离子的催化作用下形成磷酸二酯键[33].转录的精确度由碱基配对及 RNA-DNA杂交链决定.这种与蛋白结合的杂交链的构象为一种介于A-和B-DNA之间的非标准的中间型[34].碱基的错配会导致杂交链的不稳定.
3.4 启动子识别,起始中断和启动子逃逸
揭示RNA聚合酶II结构的重要性不仅仅在于其对转录机制的研究,而且使大的功能复合物结构的研究成为可能,其与通用转录因子和调节器一起对于真核转录的调节至关重要.Kornberg已阐明通用转录因子TFIIB与RNA聚合酶II复合物的结构[35].TFIIB和TBP可以在特定的情况下与RNA聚合酶和DNA形成最小的起始复合物.共晶图片中可以清楚地看到TFIIB的C末端结构域只有1个α-螺旋,在TFIIB-TBP-DNA复合物[36]中,TBP使 TATA box弯曲以便指导下游的DNA可进入活性位点,TATA box与转录起始位点只有25nt（核苷酸）,这一距离是大多RNA聚合酶II启动子的共性.
早期对于起始中断和启动子逃逸现象的困惑,现在都能给予很好的解释.起始中断是指当转录本延伸超过10个残基后则转录停止,而启动子逃逸则是指在大约10个RNA残基合成之后RNA聚合酶离开启动子.在TFIIB的N末端会形成一个环状结构,一直延伸到聚合酶的激活位点,在这里它与新合成的DNA/RNA链相互竞争.若环竞争胜利,RNA链则被替代,导致起始中断；若RNA链胜利,则环将被TFIIB和启动子DNA替代,RNA聚合酶从启动子上脱离,从而开始链的延伸.
4 展望
由于Roger Kornberg对于真核转录机制研究所作的贡献,使我们第一次了解了启动子的识别,转录起始的分子机制,DNA-RNA杂交链在引入核苷酸后的迁移,新合成的RNA链从DNA模版上的分离,以及引入的核苷酸要与DNA模版互补所进行的精确选择.而且,RNA聚合酶II结构的揭示是进一步研究通用转录因子和调节器在转录调节过程中作用的基础.Kornberg已经发表了RNA聚合酶和TFIIB共晶体的X-射线结构图,以及聚合酶-通用转录因子-调节器复合物的电镜结构图.一个完全的功能转录复合物的X-射线图可以为揭示转录调节的分子机制提供条件.
此研究的重要性还在于,对于转录调节的干扰可以直接用于各种癌症、炎症、心脏病以及代谢病等多种疾病的治疗.调节转录还可以控制干细胞向不同组织器官中的特异功能细胞发育.所以要真正发挥干细胞在医学上的全部潜力,移植干细胞用于治疗各类疾病、引导其只向我们所需要的细胞发育是关键,而理解转录过程则是必需的一步[2].
物理
黑体辐射
任何物体都具有不断辐射、吸收、发射电磁波的本领.辐射出去的电磁波在各个波段是不同的,也就是具有一定的谱分布.这种谱分布与物体本身的特性及其温度有关,因而被称之为热辐射.为了研究不依赖于物质具体物性的热辐射规律,物理学家们定义了一种理想物体——黑体(black body),以此作为热辐射研究的标准物体.
所谓黑体是指入射的电磁波全部被吸收,既没有反射,也没有透射( 当然黑体仍然要向外辐射).显然自然界不存在真正的黑体,但许多地物是较好的黑体近似( 在某些波段上).
基尔霍夫辐射定律(Kirchhoff),在热平衡状态的物体所辐射的能量与吸收的能量之比与物体本身物性无关,只与波长和温度有关.按照基尔霍夫辐射定律,在一定温度下,黑体必然是辐射本领最大的物体,可叫作完全辐射体.
普朗克辐射定律(Planck)则给出了黑体辐射的具体谱分布,在一定温度下,单位面积的黑体在单位时间、单位立体角内和单位波长间隔内辐射出的能量为
①在一定温度下,黑体的谱辐射亮度存在一个极值,这个极值的位置与温度有关, 这就是维恩位移定律(Wien
根据维恩定律,我们可以估算,当T～6000K时,λm ～0.48μm(绿色).这就是太阳辐射中大致的最大谱辐射亮度处.
当T～300K, λm～9.6μm,这就是地球物体辐射中大致最大谱辐射亮度处.
②在任一波长处,高温黑体的谱辐射亮度绝对大于低温黑体的谱辐射亮度,不论这个波长是否是光谱最大辐射亮度处.
如果把B(λ,T)对所有的波长积分,同时也对各个辐射方向积分,那么可得到斯特番—波耳兹曼定律(Stefan-Boltzmann),绝对温度为T的黑体单位面积在单位时间内向空间各方向辐射出的总能量为B
但现实世界不存在这种理想的黑体,那么用什么来刻画这种差异呢?对任一波长, 定义发射率为该波长的一个微小波长间隔内, 真实物体的辐射能量与同温下的黑体的辐射能量之比.显然发射率为介于0与1之间的正数,一般发射率依赖于物质特性、 环境因素及观测条件.如果发射率与波长无关,那么可把物体叫作灰体(grey body), 否则叫选择性辐射体.
宇宙微波背景辐射
（又称3K背景辐射）是一种充满整个宇宙的电磁辐射.特徵和绝对温标2.725K的黑体辐射相同.频率属於微波范围.
预测
1934年,Tolman是第一个研究有关宇宙背景辐射的人.他发现在宇宙中辐射温度的演化里温度会随著时间演化而改变；而光子的频率随时间演化(即宇宙学红移)也会有所不同.但是当两者一起考虑时,也就是讨论光谱时(是频率与温度的函数)两者的变化会抵销掉,也就是黑体辐射的形式会保留下来.
1948年,由旅美的俄国物理学家伽莫夫带领的团队估算出,如果宇宙最初的温度约为十亿度,则会残留有约5~10k 的黑体辐射.然而这个工作并没有起重视.
1964年,苏联的泽尔多维奇(Zel'dovich)、英国的霍伊尔(Hoyle)、泰勒(Tayler)、美国的皮伯斯(Peebles)等人的研究预言,宇宙应当残留有温度为几开的背景辐射,并且在厘米波段上应该是可以观测到的,从而重新引起了学术界对背景辐射的重视.美国的狄克(Dicke)、劳尔(Roll)、威尔金森(Wilkinson)等人也开始着手制造一种低噪声的天线来探测这种辐射,然而另外两个美国人无意中先于他们发现了背景辐射.
发现
1964年,美国贝尔实验室的工程师阿诺·彭齐亚斯(Penzias)和罗伯特·威尔逊(Wilson)架设了一台喇叭形状的天线,用以接受“回声”卫星的信号.为了检测这台天线的噪音性能,他们将天线对准天空方向进行测量.他们发现,在波长为7.35cm的地方一直有一个各向同性的讯号存在,这个信号既没有周日的变化,也没有季节的变化,因而可以判定与地球的公转和自转无关.
起初他们怀疑这个信号来源于天线系统本身.1965年初,他们对天线进行了彻底检查,清除了天线上的鸽子窝和鸟粪,然而噪声仍然存在.于是他们在《天体物理学报》上以《在4080兆赫上额外天线温度的测量》为题发表论文正式宣布了这个发现.
紧接着狄克、皮伯斯、劳尔和威尔金森在同一杂志上以《宇宙黑体辐射》为标题发表了一篇论文,对这个发现给出了正确的解释：即这个额外的辐射就是宇宙微波背景辐射.这个黑体辐射对应到一个3k的温度.之后在观测其他波长的背景辐射推断出温度约为2.7K.
宇宙背景辐射的发现在近代天文学上具有非常重要的意义,它给了大爆炸理论一个有力的证据,并且与类星体、脉冲星、星际有机分子一道,并称为20世纪60年代天文学“四大发现”.彭齐亚斯和威尔逊也因发现了宇宙微波背景辐射而获得1978年的诺贝尔物理学奖.
进一步的研究
后来人们在不同波段上对微波背景辐射做了大量的测量和详细的研究,发现它在一个相当宽的波段范围内良好地符合黑体辐射谱,并且在整个天空上是高度各相同性的,只是具有一个微小的偶极各相异性：在赤经 11.3±0.1 h,赤纬 4±2°的地方温度略高,在相反的方向温度略低,人们认为这是由银河系运动带来的多普勒效应所引起的.
COBE的成果
根据1989年11月升空的微波背景探测卫星(COBE,Cosmic Background Explorer)测量到的结果,宇宙微波背景辐射谱非常精确地符合温度为 2.726±0.010K 的黑体辐射谱,证实了银河系相对于背景辐射有一个相对的运动速度,并且还验证,扣除掉这个速度对测量结果带来的影响,以及银河系内物质辐射的干扰,宇宙背景辐射具有高度各向同性,温度涨落的幅度只有大约百万分之五.目前公认的理论认为,这个温度涨落起源于宇宙在形成初期极小尺度上的量子涨落,它随着宇宙的暴涨而放大到宇宙学的尺度上,并且正是由于温度的涨落,造成物质宇宙物质分布的不均匀性,最终得以形成诸如星系团等的一类大尺度结构.
WMAP的发现
2003年,美国发射的威尔金森微波各向异性探测器对宇宙微波背景辐射在不同方向上的涨落的测量表明,宇宙的年龄是137±1亿年,在宇宙的组成成分中,4%是一般物质,23%是暗物质,73%是暗能量.宇宙目前的膨胀速度是71公里每秒每百万秒差距,宇宙空间是近乎于平直的,它经历过暴涨的过程,并且会一直膨胀下去.
生理学或医学奖
RNA干扰现象.
【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式,是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一.RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA.RNAi具有生物催化反应特征,反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与.RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景.
【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III启动子
【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient origin.RNAi is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug.
1 背景
20 多年前,在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的.因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制,Jorgensen将这种现象命名为协同抑制（cosuppression）.在真菌中也有类似的现象,1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这种现象.当时将这种现象命名为基因表答的阻抑作用(quelling)〔1〕.
通过对转基因植物的研究,发现相应基因的转录并不受影响,将这种现象称为基因转录后沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）.转录后的基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子和RNA病毒的防御机制,可能在植物和动物分化之前就已经出现.1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA （double-stranded RNA）注入线虫,结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默.将这种由dsRNA（double-stranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用（RNA interference RNAi）〔2〕.
2 RNAi的分子机制
dsRNA（double-stranded RNA）可以介导基因沉默作用,以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点.dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子.哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA),其一是特异性路径：特殊dsRNA的序列用于RNAi,起始阶段dsRNA被切成siRNA（small interfering RNA 或short interfering RNAs）.siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子,能提供一定的信息,允许一个特定的mRNA被降解.siRNA正义链与反义链各有21个碱基,其中19个碱基配对,再每条链的3’端都有2个不配对的碱基（图1）.
另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA,抑制所有蛋白质的合成.长的dsRNA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子,导致翻译抑制.也可以通过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L,导致非特异的RNA降解〔3〕.
关于特异性的RNA作用机制模型,包括起始阶段和效应阶段〔4〕.起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,属内切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA）〔5〕.Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构.
在RNAi 的效应阶段,siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA－induced silencing complex or RISC）,在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP〔5〕.由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合,随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达.RISC由多种蛋白成分组成,包括核酸酶,解旋酶和同源RNA链搜索活性等.
最新研究表明,Argonaute蛋白为RISC的特有成分,被比喻成“切薄片的机器”.Argonaute有一个月牙型的底座由三部分组成,分别为N-端（amino-terminal）、中部（middle）和PIWI区域（PIWI domain）.在月牙底座上面有一个PAZ部分,由茎杆结构支撑.Argonature蛋白有一个明显的凹槽贯穿整个蛋白,凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合.siRNA解旋后, siRNA单链的3’端伸入PAZ的裂缝中,整个单链沿着PAZ伸展开,同时目的片段mRNA结合于新月型底座.mRNA与siRNA互相配对形成双链后,在离单链siRNA5’端9个碱基处（即离siRNA3’端11－12个碱基处）切割mRNA
这类启动子有大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子〔8〕.采用RNA pol III启动子是因为它结构简单,而且可在哺乳动物细胞中表达小分子RNA,并且它可通过一串（3－6个）U来终止转录的,这刚好符合原始设计的siRNA的3’端含有2个突出碱基U( Elbashir 2002).使用这类载体,首先要设计2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,然后订购这2段DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游.克隆可能要几周甚至数月的时间,为保证克隆的序列的正确性,还要进行测序.
病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞并维持较长时间的基因沉默〔9〕.
siRNA目标位点的筛选是实现RNAi作用的关键,一般有以下几个原则〔10,11〕：(1) 在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列,起始是AA；(2)找2～4个小片段的RNA,通过SECs（siRNA expression cassettes,SECs）筛选最有效的siRN
参考资料：http://www.studa.net/Clinical/060705/15180268-2.html
物理:10月3日当地时间上午上午11时45分(北京时间17时45分),瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将2006年度诺贝尔物理学奖授予两名美国科学家约翰-马瑟和乔治-斯莫特,以表彰他们发现了黑体形态和宇宙微波背景辐射的扰动现象
生理学或医学奖2006年诺贝尔生理学或医学奖授予了两名美国科学家安德鲁.法尔和克雷格.梅洛,以表彰他们发现了RNA干扰现象.
化学 真核转录的分子基础
1 引言
瑞典皇家科学院10月4日宣布,美国斯坦福大学医学院教授罗杰?科恩伯格Roger D. Kornberg因在“真核转录的分子基础”研究领域所作出的杰出贡献,而独自获得2006年度诺贝尔化学奖[1-3].
Roger D. Kornberg现年59岁,1947年出生于美国密苏里州圣路易市,在斯坦福大学获得博士学位,目前供职于该大学医学院.其父Arthur Kornberg因致力于DNA复制的研究,是1959年的诺贝尔医学或生理学奖得主之一[3].老Kornberg获奖原因是因为破解基因信息是如何从一个DNA复制到另一个DNA的,而小Kornberg则是在遗传信息如何从DNA转录到mRNA的过程中做出了卓越贡献.
DNA分子由G, C, A和T 4个不同的碱基组成.RNA同样由G, C,A和U 4个相对应的碱基组成.这4个不同的碱基排列组合即构成了遗传信息.DNA分子为一个双链螺旋,两链间可形成G, C配对和A,T配对（Watson, Crick 和 Wilkins 因此获得1962年的诺贝尔生理学或医学奖）,这保证了遗传信息的可靠储存[2].
转录即存储于DNA中的遗传信息在RNA聚合酶作用下被激活并拷贝到互补的mRNA链上.最终mRNA上的遗传信息由核糖体翻译成有功能的蛋白质.转录是生命活动中最中心的过程之一,有着复杂的调节机制.Kornberg正是在真核细胞的转录及其调节的分子机制中做出了突破性的贡献.他将结构生物学与生化技术相结合,从而得以在酵母中分离出高纯度的RNA聚合酶及其与模版DNA、mRNA、核苷酸底物、调节蛋白结合的功能相关复合物.
Kornberg主要贡献是其创造性地制作了详细的晶体结构图片,用于描述真核细胞中转录过程的整个机制.我们可以看到新的RNA链如何逐渐生成,以及转录过程中必不可少的其它若干分子的作用.由于这些图片可以清楚地区分不同的原子,从而使转录过程和转录调节机制的理解成为可能[2].
2 研究背景
真核转录研究始于50年前,Weiss和Gladstone[4]于1959在大鼠肝脏细胞核中发现了RNA聚合酶的活性.这一发现使转录研究成为生命进程中一个至关重要的研究领域.但是从大鼠肝脏细胞核中提取RNA聚合酶极为困难,而从细菌中纯化酶则相对简单得多.因此,原核转录研究率先开展起来,1965年诺贝尔生理学或医学奖即颁给了Jacob, Monod和Lwoff,以表彰他们在细菌基因表达的转录调节中所作出的贡献.
很长一段时间以来,人们认为在所有细胞中的基因结构和转录机制与细菌中的是相同的.后来才得知真核细胞中,例如酵母和人类,染色体DNA需要与蛋白质结合,包装成核小体,这种高度压缩的染色质形式在细菌中是没有的.真核转录机制比原核要复杂得多.所以,了解真核细胞中RNA聚合酶的作用和调节机制对于解析转录调节以及细胞中基因表达的调控至关重要.
Roeder and Rutter[5]和Chambon[6]证实,真核细胞包含3种不同的RNA聚合酶(I-III).蛋白编码基因由RNA聚合酶II负责转录.真核RNA聚合酶由多个亚单位组成.细菌RNA聚合酶由4个亚单位和1个可变亚基Sigma组成[7].Sigma是聚合酶识别启动子和起始转录所必需的.启动子即DNA上的一段特殊序列,用于起始RNA的合成.对于启动子的研究最早始于原核细胞的转录,但真核的启动子比原核还要长.1981年Banerji 等[8]和Moreau等[9]鉴别了基因特异性元件“增强子”.但是真核细胞中没有Sigma因子.因此要研究真核转录机制,就需要建立依赖真核RNA聚合酶II的以外源DNA为模版的可在特异启动子下转录的细胞体系.
1979年Weil等[10]利用纯化的RNA聚合酶,在提取的人类组织培养细胞中以一个病毒启动子进行特异性的起始转录.1980年Matsui 等[11]通过生化分馏法揭示了RNA聚合酶II复合体中存在多个转录因子,即RNA聚合酶II通用转录因子（TFIIB, D, E, F和H）.RNA聚合酶II在这5个通用转录因子的协助下识别基因起始位点,分离DNA模版链,对一条链进行转录生成mRNA.
3 2006年诺贝尔化学奖研究成果简介
3.1 体外酵母细胞转录体系的建立
Roger Kornberg 致力于转录领域的研究始于他在英国剑桥大学做博士后的时候.X-射线衍射证实,染色质是由大约10nm的重复亚基所组成.1973年Hewish和Burgoyne[12]用核酸酶处理染色质得到许多大小相同的断裂产物.Kornberg和Thomas 在1974年[13]发现组蛋白H3和H4在溶液中形成(H3)2(H4)2的四聚体.同年Kornberg[14]提出染色质的基本单位,即核小体是由1个组蛋白八聚体和200bp（碱基对）长的DNA所组成.
Kornberg回到斯坦福大学以后仍致力于真核生物的转录调节研究.他的重大贡献之一即培育了新的体外酵母细胞转录体系[15,16],使利用啤酒酵母（saccharomyces cerevisiae）作为真核生物的研究模型成为可能.Kornberg实验室为此体系的建立花费了10年时间,其间许多实验室因为几年中没有任何进展而纷纷放弃.但是正是这个酵母细胞体系的建立,为Kornberg创造了合适的RNA聚合酶和通用转录因子,为其研究提供晶体、创造了条件.
3.2 酵母RNA聚合酶及转录复合物结构的描述
3.2.1 调节器的发现
包含纯化的RNA聚合酶II,5个通用转录因子TFIIB,E,F,H和TATA结合蛋白的体系只能维持基础转录,而对于基因特异性激活蛋白的转录则无能为力.对这一问题的研究导致了调节器的发现,并使真核转录的一些早期遗传数据得到很好的解释.调节器是由大约20个不同蛋白组成的多蛋白复合体[17-19],在从酵母到人类的所有真核生物中,调节器的作用是将正负信号从与DNA结合的特异基因转录因子传递给RNA聚合酶II及其通用转录因子（图2）,其中图2物质包含DNA、通用转录因子TBP,TFIIB,E,F和H、调节器、RNA聚合酶以及与增强子结合的特异性转录因子.在探索转录过程研究中调节器的发现是一个里程碑.
随着调节器被分离,真核基因调节和转录的基本组分已被建立,即通用转录因子、调节器和RNA聚合酶II.细菌中的转录抑制和激活是其直接与RNA聚合酶结合,从而影响与启动子的结合.真核中染色质和调节器在基因特异性转录因子与RNA聚合酶之间起作用,使得调节更加复杂化.
Asturias等在1999年[20]得到了RNA聚合酶II-调节器复合物的电镜图,此图显示调节器围绕聚合酶成月牙形.调节器包含大约20多肽,1MDa.近来有关功能的调节器头部分子的表达和纯化已有报道.此复合物只有7个亚基,分子量为223kDa[21].调节器头部分子与RNA聚合酶的相互作用需要通用转录因子TFIIF的参与.
3.2.2 酵母RNA聚合酶及转录复合物结构描述
早在10年前,X-射线结晶学已描述了TBP结合于TATA-box DNA,以及TFIIB,TBP和DNA三重复合物的结构[22-25].Kornberg则首先意识到所有真核转录元件的组装可能是以RNA聚合酶作为一个平台,但是酵母RNA聚合酶II的复杂性以及纯化复合物的少量和不稳定性成为晶体研究的瓶颈.Kornberg用电镜和X-射线结晶学相结合,依据自己20年来对蛋白表达纯化的研究经验和二维蛋白结晶的方法最终解决了这个问题[26].
关于建立体外酵母转录系统的研究,Kornberg在2001年取得突破性进展.他发表于Science的两篇文章[27,28]分别描述了 0.28nm溶液中含有10个亚基的酵母RNA聚合酶结构以及包含RNA聚合酶,模版DNA,RNA产物的转录复合物结构.在此结构中,两个大亚基位于中间核酸结合空穴的两边,许多小亚基在外围.空穴中可见一个α-螺旋与其中一个大亚基相连,此螺旋穿过形成磷酸二酯键和延伸RNA链的活性中心.在空穴中可清楚看到一条DNA链和正在合成的RNA链之间核苷酸的接合（图3）.
图3中白色为RNA聚合酶,绿色为连接螺旋,粉色为激活位点金属离子,蓝色为DNA螺旋,红色为新合成的RNA.
Kornberg实验室后续发表的文章中,详尽描述了RNA聚合酶与DNA、RNA、插入的核苷酸或其他蛋白结合的不同的功能复合物的晶体结构.建立了包括5个通用转录因子在内的转录起始复合物的模型[27],即5个通用转录因子直接与双链DNA启动子结合,而RNA聚合酶只能与解旋之后的DNA相结合,解旋即DNA模版旋转90°,使其可以进入聚合酶的活性位点空穴.
3.3 真核转录分子机制的阐明
大量的数据为转录过程的动态描述提供了前提条件.Kornberg创造性地从溶液中去除了一种必需的碱基,当RNA的合成到达缺失碱基需要插入的位点,其合成过程半途中断.这正描述了在RNA链3'末端与掺入的核苷酸形成磷酸二酯键之后以及DNA-RNA杂交链发生迁移之前的分子结构[28].若此复合物中引入核酸的结合位点空缺,即为DNA-RNA杂交链迁移后的阶段[29].然后Kornberg创建它们的分子晶体,并用X-射线衍射获得其晶体排列的分子图,计算机可进一步精确计算分子中原子的位置.虽然当今这种生物大分子结晶的方法已被广泛应用,但通常只是观察组装后的复合物或是单个的分子,而真正用它去捕捉一个化学反应的过程还是很困难的.Kornberg革命性的贡献即在于此,他最先创建了整个转录机制的全流程图,大致分为下面3个过程.
3.3.1 迁移
首先是迁移过程.图3中绿色表示的连接螺旋被认为在转录DNA-RNA杂交链的迁移过程中起到棘齿的作用[28,30].RNA聚合酶分子使DNA双链处于正确的位置并形成空穴,只有与DNA正确配对的碱基才能进入空穴参与RNA的合成.一旦新的碱基插入正确的位置,DNA链就会被连接螺旋驱动向前迁移.连接螺旋末端的两个残基在苏氨酸-831和丙氨酸-832激活中心的下面,连接杂交链底部的碱基.由于聚合酶形状持续自发地变化从而导致了弹簧式的结构.连接螺旋的摆动会使DNA-RNA杂交链迁移0.3nm或一个核苷酸的距离.DNA链在新的碱基结合到延伸的RNA链之后,就以这种方式一次次地迁移到正确的位置[2].
3.3.2 RNA链与DNA链分离
其次是分离过程.迁移后阶段的结构图显示了聚合酶上的盖状环是如何将新合成的RNA链在位点-8与模版DNA分离,从而在-9和-10位将双链彻底分开的.最后添加在RNA上的核酸为位点-1.盖状环与另两个蛋白环一起阻止DNA与RNA链的重新结合[29].
3.3.3 核酸的选择
最后是核酸筛选过程.核苷酸通过漏斗样的结构被筛选运输到RNA聚合酶的活性中心.在迁移后阶段转录复合物与核苷酸和DNA在位点+1结合,同时还有很多核苷酸不与其结合,故在酶的激活位点核苷酸是如何被筛选的也是一个很有趣的问题[31].筛选过程又可分为两步,首先核苷酸反向结合到位于活性位点下面的进入位点.此结合将大大延长核苷酸在激活位点区域的寿命[32].然后核苷酸发生逆转进入活性位点,从而有选择性地与 DNA模版相结合.若引入的碱基与模版匹配,则在两个金属离子的催化作用下形成磷酸二酯键[33].转录的精确度由碱基配对及 RNA-DNA杂交链决定.这种与蛋白结合的杂交链的构象为一种介于A-和B-DNA之间的非标准的中间型[34].碱基的错配会导致杂交链的不稳定.
3.4 启动子识别,起始中断和启动子逃逸
揭示RNA聚合酶II结构的重要性不仅仅在于其对转录机制的研究,而且使大的功能复合物结构的研究成为可能,其与通用转录因子和调节器一起对于真核转录的调节至关重要.Kornberg已阐明通用转录因子TFIIB与RNA聚合酶II复合物的结构[35].TFIIB和TBP可以在特定的情况下与RNA聚合酶和DNA形成最小的起始复合物.共晶图片中可以清楚地看到TFIIB的C末端结构域只有1个α-螺旋,在TFIIB-TBP-DNA复合物[36]中,TBP使 TATA box弯曲以便指导下游的DNA可进入活性位点,TATA box与转录起始位点只有25nt（核苷酸）,这一距离是大多RNA聚合酶II启动子的共性.
早期对于起始中断和启动子逃逸现象的困惑,现在都能给予很好的解释.起始中断是指当转录本延伸超过10个残基后则转录停止,而启动子逃逸则是指在大约10个RNA残基合成之后RNA聚合酶离开启动子.在TFIIB的N末端会形成一个环状结构,一直延伸到聚合酶的激活位点,在这里它与新合成的DNA/RNA链相互竞争.若环竞争胜利,RNA链则被替代,导致起始中断；若RNA链胜利,则环将被TFIIB和启动子DNA替代,RNA聚合酶从启动子上脱离,从而开始链的延伸.
4 展望
由于Roger Kornberg对于真核转录机制研究所作的贡献,使我们第一次了解了启动子的识别,转录起始的分子机制,DNA-RNA杂交链在引入核苷酸后的迁移,新合成的RNA链从DNA模版上的分离,以及引入的核苷酸要与DNA模版互补所进行的精确选择.而且,RNA聚合酶II结构的揭示是进一步研究通用转录因子和调节器在转录调节过程中作用的基础.Kornberg已经发表了RNA聚合酶和TFIIB共晶体的X-射线结构图,以及聚合酶-通用转录因子-调节器复合物的电镜结构图.一个完全的功能转录复合物的X-射线图可以为揭示转录调节的分子机制提供条件.
此研究的重要性还在于,对于转录调节的干扰可以直接用于各种癌症、炎症、心脏病以及代谢病等多种疾病的治疗.调节转录还可以控制干细胞向不同组织器官中的特异功能细胞发育.所以要真正发挥干细胞在医学上的全部潜力,移植干细胞用于治疗各类疾病、引导其只向我们所需要的细胞发育是关键,而理解转录过程则是必需的一步[2].
物理
黑体辐射
任何物体都具有不断辐射、吸收、发射电磁波的本领.辐射出去的电磁波在各个波段是不同的,也就是具有一定的谱分布.这种谱分布与物体本身的特性及其温度有关,因而被称之为热辐射.为了研究不依赖于物质具体物性的热辐射规律,物理学家们定义了一种理想物体——黑体(black body),以此作为热辐射研究的标准物体.
所谓黑体是指入射的电磁波全部被吸收,既没有反射,也没有透射( 当然黑体仍然要向外辐射).显然自然界不存在真正的黑体,但许多地物是较好的黑体近似( 在某些波段上).
基尔霍夫辐射定律(Kirchhoff),在热平衡状态的物体所辐射的能量与吸收的能量之比与物体本身物性无关,只与波长和温度有关.按照基尔霍夫辐射定律,在一定温度下,黑体必然是辐射本领最大的物体,可叫作完全辐射体.
普朗克辐射定律(Planck)则给出了黑体辐射的具体谱分布,在一定温度下,单位面积的黑体在单位时间、单位立体角内和单位波长间隔内辐射出的能量为
①在一定温度下,黑体的谱辐射亮度存在一个极值,这个极值的位置与温度有关, 这就是维恩位移定律(Wien
根据维恩定律,我们可以估算,当T～6000K时,λm ～0.48μm(绿色).这就是太阳辐射中大致的最大谱辐射亮度处.
当T～300K, λm～9.6μm,这就是地球物体辐射中大致最大谱辐射亮度处.
②在任一波长处,高温黑体的谱辐射亮度绝对大于低温黑体的谱辐射亮度,不论这个波长是否是光谱最大辐射亮度处.
如果把B(λ,T)对所有的波长积分,同时也对各个辐射方向积分,那么可得到斯特番—波耳兹曼定律(Stefan-Boltzmann),绝对温度为T的黑体单位面积在单位时间内向空间各方向辐射出的总能量为B
但现实世界不存在这种理想的黑体,那么用什么来刻画这种差异呢?对任一波长, 定义发射率为该波长的一个微小波长间隔内, 真实物体的辐射能量与同温下的黑体的辐射能量之比.显然发射率为介于0与1之间的正数,一般发射率依赖于物质特性、 环境因素及观测条件.如果发射率与波长无关,那么可把物体叫作灰体(grey body), 否则叫选择性辐射体.
宇宙微波背景辐射
（又称3K背景辐射）是一种充满整个宇宙的电磁辐射.特徵和绝对温标2.725K的黑体辐射相同.频率属於微波范围.
预测
1934年,Tolman是第一个研究有关宇宙背景辐射的人.他发现在宇宙中辐射温度的演化里温度会随著时间演化而改变；而光子的频率随时间演化(即宇宙学红移)也会有所不同.但是当两者一起考虑时,也就是讨论光谱时(是频率与温度的函数)两者的变化会抵销掉,也就是黑体辐射的形式会保留下来.
1948年,由旅美的俄国物理学家伽莫夫带领的团队估算出,如果宇宙最初的温度约为十亿度,则会残留有约5~10k 的黑体辐射.然而这个工作并没有起重视.
1964年,苏联的泽尔多维奇(Zel'dovich)、英国的霍伊尔(Hoyle)、泰勒(Tayler)、美国的皮伯斯(Peebles)等人的研究预言,宇宙应当残留有温度为几开的背景辐射,并且在厘米波段上应该是可以观测到的,从而重新引起了学术界对背景辐射的重视.美国的狄克(Dicke)、劳尔(Roll)、威尔金森(Wilkinson)等人也开始着手制造一种低噪声的天线来探测这种辐射,然而另外两个美国人无意中先于他们发现了背景辐射.
发现
1964年,美国贝尔实验室的工程师阿诺·彭齐亚斯(Penzias)和罗伯特·威尔逊(Wilson)架设了一台喇叭形状的天线,用以接受“回声”卫星的信号.为了检测这台天线的噪音性能,他们将天线对准天空方向进行测量.他们发现,在波长为7.35cm的地方一直有一个各向同性的讯号存在,这个信号既没有周日的变化,也没有季节的变化,因而可以判定与地球的公转和自转无关.
起初他们怀疑这个信号来源于天线系统本身.1965年初,他们对天线进行了彻底检查,清除了天线上的鸽子窝和鸟粪,然而噪声仍然存在.于是他们在《天体物理学报》上以《在4080兆赫上额外天线温度的测量》为题发表论文正式宣布了这个发现.
紧接着狄克、皮伯斯、劳尔和威尔金森在同一杂志上以《宇宙黑体辐射》为标题发表了一篇论文,对这个发现给出了正确的解释：即这个额外的辐射就是宇宙微波背景辐射.这个黑体辐射对应到一个3k的温度.之后在观测其他波长的背景辐射推断出温度约为2.7K.
宇宙背景辐射的发现在近代天文学上具有非常重要的意义,它给了大爆炸理论一个有力的证据,并且与类星体、脉冲星、星际有机分子一道,并称为20世纪60年代天文学“四大发现”.彭齐亚斯和威尔逊也因发现了宇宙微波背景辐射而获得1978年的诺贝尔物理学奖.
进一步的研究
后来人们在不同波段上对微波背景辐射做了大量的测量和详细的研究,发现它在一个相当宽的波段范围内良好地符合黑体辐射谱,并且在整个天空上是高度各相同性的,只是具有一个微小的偶极各相异性：在赤经 11.3±0.1 h,赤纬 4±2°的地方温度略高,在相反的方向温度略低,人们认为这是由银河系运动带来的多普勒效应所引起的.
COBE的成果
根据1989年11月升空的微波背景探测卫星(COBE,Cosmic Background Explorer)测量到的结果,宇宙微波背景辐射谱非常精确地符合温度为 2.726±0.010K 的黑体辐射谱,证实了银河系相对于背景辐射有一个相对的运动速度,并且还验证,扣除掉这个速度对测量结果带来的影响,以及银河系内物质辐射的干扰,宇宙背景辐射具有高度各向同性,温度涨落的幅度只有大约百万分之五.目前公认的理论认为,这个温度涨落起源于宇宙在形成初期极小尺度上的量子涨落,它随着宇宙的暴涨而放大到宇宙学的尺度上,并且正是由于温度的涨落,造成物质宇宙物质分布的不均匀性,最终得以形成诸如星系团等的一类大尺度结构.
WMAP的发现
2003年,美国发射的威尔金森微波各向异性探测器对宇宙微波背景辐射在不同方向上的涨落的测量表明,宇宙的年龄是137±1亿年,在宇宙的组成成分中,4%是一般物质,23%是暗物质,73%是暗能量.宇宙目前的膨胀速度是71公里每秒每百万秒差距,宇宙空间是近乎于平直的,它经历过暴涨的过程,并且会一直膨胀下去.
生理学或医学奖
RNA干扰现象.
【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式,是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一.RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA.RNAi具有生物催化反应特征,反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与.RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景.
【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III启动子
【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient origin.RNAi is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug.
1 背景
20 多年前,在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的.因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制,Jorgensen将这种现象命名为协同抑制（cosuppression）.在真菌中也有类似的现象,1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这种现象.当时将这种现象命名为基因表答的阻抑作用(quelling)〔1〕.
通过对转基因植物的研究,发现相应基因的转录并不受影响,将这种现象称为基因转录后沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）.转录后的基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子和RNA病毒的防御机制,可能在植物和动物分化之前就已经出现.1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA （double-stranded RNA）注入线虫,结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默.将这种由dsRNA（double-stranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用（RNA interference RNAi）〔2〕.
2 RNAi的分子机制
dsRNA（double-stranded RNA）可以介导基因沉默作用,以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点.dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子.哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA),其一是特异性路径：特殊dsRNA的序列用于RNAi,起始阶段dsRNA被切成siRNA（small interfering RNA 或short interfering RNAs）.siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子,能提供一定的信息,允许一个特定的mRNA被降解.siRNA正义链与反义链各有21个碱基,其中19个碱基配对,再每条链的3’端都有2个不配对的碱基（图1）.
另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA,抑制所有蛋白质的合成.长的dsRNA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子,导致翻译抑制.也可以通过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L,导致非特异的RNA降解〔3〕.
关于特异性的RNA作用机制模型,包括起始阶段和效应阶段〔4〕.起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,属内切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA）〔5〕.Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构.
在RNAi 的效应阶段,siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA－induced silencing complex or RISC）,在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP〔5〕.由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合,随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达.RISC由多种蛋白成分组成,包括核酸酶,解旋酶和同源RNA链搜索活性等.
最新研究表明,Argonaute蛋白为RISC的特有成分,被比喻成“切薄片的机器”.Argonaute有一个月牙型的底座由三部分组成,分别为N-端（amino-terminal）、中部（middle）和PIWI区域（PIWI domain）.在月牙底座上面有一个PAZ部分,由茎杆结构支撑.Argonature蛋白有一个明显的凹槽贯穿整个蛋白,凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合.siRNA解旋后, siRNA单链的3’端伸入PAZ的裂缝中,整个单链沿着PAZ伸展开,同时目的片段mRNA结合于新月型底座.mRNA与siRNA互相配对形成双链后,在离单链siRNA5’端9个碱基处（即离siRNA3’端11－12个碱基处）切割mRNA
这类启动子有大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子〔8〕.采用RNA pol III启动子是因为它结构简单,而且可在哺乳动物细胞中表达小分子RNA,并且它可通过一串（3－6个）U来终止转录的,这刚好符合原始设计的siRNA的3’端含有2个突出碱基U( Elbashir 2002).使用这类载体,首先要设计2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,然后订购这2段DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游.克隆可能要几周甚至数月的时间,为保证克隆的序列的正确性,还要进行测序.
病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞并维持较长时间的基因沉默〔9〕.
siRNA目标位点的筛选是实现RNAi作用的关键,一般有以下几个原则〔10,11〕：(1) 在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列,起始是AA；(2)找2～4个小片段的RNA,通过SECs（siRNA expression cassettes,SECs）筛选最有效的siRN
参考资料：http://www.studa.net/Clinical/060705/15180268-2.html