T载体双酶切看不到目的条带

要构建重组载体的目的就是把目的基因连到载体上,所以最有效的重组DNA是目的基因-载体.目的基因-目的基因和载体-载体都是失败的结果,这种结果的产生相对导致基因-载体的结果产生率下降.一般做重组载体选择

如果实验目的只是基因型鉴定,对PCR产物无其他要求的话,二聚体并非不能忍受,可以尝试以下方法优化反应条件：1.确定DNA模板为阳性,即确定含有目标序列；2.对退火温度设置温度梯度,琼脂糖电泳检测是否有

存在两种可能性,第一,引物设计错误,可以将引物和参考序列进行拼接后看看能不能顺利拼接,以及拼接之后的目的片段长度；第二,可能是非特异扩增,这个时侯如果确定引物位置没有问题,可以调整退火温度,以及PCR

解决办法：1、cla1是一个比较不常见的酶,可能酶切体系和ECOR1的缓冲体系不一样,试着分别酶切,就是先切cla1,然后纯化后切ECOR1；或者查找哪个酶的酶切效率高些,那个后切；2、3个小时可能太

我觉得用elutionbuffer没太大的影响,如果你非要觉得不好的话,只能在转化一遍重新提质粒或者抽成干粉再加水.我们一般用水就行.实在不行去测序呀.提的质粒和空质粒可以比较,如果你插入的基因足够大

可以照胶的时候去调节亮度,对比和γ射线,然后会清楚一些.同时,你优化下PCR扩增条件之类的,提高扩增效率.希望对你有帮助.望采纳.再问：感谢回答，我会试试调节亮度。请问，这跟电泳时使用的染色液有关系吗

假阳性1.平板是否加抗性?2.引物设计是否有问题?3.载体自连现象是不是很严重?建议做个对照4.菌落pcr条件是否合适?

原来扩增的时候就有两条带,回收的时候（是凝胶回收吗?）可能因为产物浓度过大,导致两条带没跑开,让你一起切下来了（回收后电泳检测了没?）,所以连接后有两种克隆.至于说为什么会出现两种克隆,要具体问题具体

用的是T-simple吗?如果不是simple载体,有可能切开的不是你引入的的没切位点,而是载体本身的再问：用的是T-simple啊，发现酶切条带都变大了再答：大了多少？是用的takara的pmd18

M13F(-47)：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACM13R(-48)：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

恩就是质粒感受态的大肠杆菌把T载体转进去然后摇菌培养这样载体就会随着菌的扩增而扩增然后就可以提质粒拿去测序或者别的后续实验因为连接完的载体浓度是很小的

一个可能原因,DNA结合了蛋白质,所以跑不出去.加loadingbuffer后加热（90度以上）一下再上样试试.另外一个原因,你的产物特别大（不一定是目标产物）再问：我做的是菌落PCR电泳检测结果，我

理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应.但是,以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉,但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）.而以T载体为媒介,

恐怕还是cDNA的问题,actin因为量比较丰富,所以即使破坏一些仍能P出来,但你的目的基因就不同了

通常先分析一下目的基因上存在哪些常见的酶切位点,再选择合适的克隆载体.保证你双酶切的位点在目的基因上不会出现.PMD18-T克隆位点两侧的酶切位点比较多,很常用的.

发个照片看看.

有很多影响因素：模板浓度,引物浓度,酶在反应过程中的不断消耗,循环数和温度等等.如果你已经P出来目的片段的话温度应该是适合的,可以加大模板和引物的量,建议回收片段后作为模板再P,这样得到的片段会较亮.

酶切位点消失啦,测个序看看.再问：测序了，说我的链接质粒没有信号再答：重新做吧，多半不对！

选择合适的表达质粒如pET系列,再选择合适的两个酶切位点,先从T载体上切下基因,与酶切好的表达质粒相连,就好了

目的基因有没有连接到载体上?有没有经过测序验证?