作业帮PCR上游和下游引物各有Tm值,怎样确定退火温度
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/04 20:45:52
就是加酶切位点了呗一般长了是升高了不过不用管酶切位点的再问：也就是说，我的xxxxxNNNNN的Tm值和NNNNN一样了么？再答：计算出来的值肯定不一样不过你做的时候还是按照原来的退火温度就行了P不出
你理解的没错.上下游引物同时用才能特异性扩增中间的那部分片段.
那就扩增不出来了呗~再问：不大可能扩不出来，最多是扩的乱七八糟，因为一种引物“失效”，那它起码也是“不对称PCR”啊。请问允许的最大差异是多大？再答：你用primerpremier设计引物不就得了
这个百度看一下吧
退火温度
不同的引物当然退火温度也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出Tm值是多少.在做PCR的时候,将退火温度设定的稍微低于Tm值一点,降低引物的特异性,可能会好点.当然,做PCR有一定的运气成分,同
你设计出来以后,BLAST一下,扩增是特异的,接着就像一般的real-timepcr一样做的行了,不需要上游引物高一点.引物的Tm值要求和你用的哪个公司的酶和你用的哪个仪器有关.
FPrimer:5'-TTGTAAAAAAATTAAATTAA-3'RPrimer:5'-CATATTTTAATTAATATTTC-3'你这个序列AT含量太高,尤其是5'端A有7个连续重复,引物本身很
上游：5ggaattcatgtttagtttgaaaaaaac3下游：5gggttcgaattagacattgccaacatatt3你要的并不是鉴定引物,而是扩增引物根本不用软件
ThebesttemperatureforTaqpolymeraseis72C.IfyourprimerTmishigherthan72C,thenthepolymerasewouldnotworkw
Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度.我们PCR时候,当然不能用Tm值来作为退火的温度.一般来说,退火温度比Tm值要低上5度左右.但是这个也不是绝对的.建议你如果说模板比较充足的话,做一个梯
Tm值本来就是人为定的一个预测值,三个Tm值代表的是不同的计算方法,常用的是第三种2*AT+4GC.看退火温度时,酶切位点和保护碱基一般是不考虑在内的,因为pcr扩增时这段序列一般是不跟模板结合的,所
个人推荐使用PrimerPremier5
上游引物：GAATTCacgcgcaagattagg（后面可以继续加几个碱基,用PRIMER5.0看一下,引物设计多少个碱基合适,每个基因序列不同.我用TOYOBO的KODPLUS的话,就一般引物设计
5':CGGAATTCACGCGCAAGATTAGGTGGGG3':CGGGATCCCCTTGGGAAGAAAAAGCAAG引物组成为：保护碱基+酶切位点+目的基因末端序列.由于你要扩增全部这段序列,
不能,扩增酶扩增一定长度后会脱落,但你引物的互补链没有扩增,无法呈指数扩增,30个循环后只是扩增30倍根本没产物
第一次PCR产物不要做任何处理,直接吸取1微升做第二轮PCR的模板.第二轮PCR过后再跑胶回收你的目的条带.外引物不在你的目的基因上,而在你的目的基因两侧.所以你设计外引物时是从一个很宽泛的范围内寻找
PCR反应第一步DNA双链变性逐步打开,第二部退火时两个引物各自与其互补链的5‘端通过碱基互补结合,并在第三步延伸反应时在引物的3’端不断加上新的碱基从而不断向前延长.每个引物的作用都一样.用上上下游