未连接的T载体转化到大肠杆菌时会不会环化

一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测.[主要试剂主要试剂]主要试剂1、LB培养基.2

已经得到扩增的目的基因片段和克隆载体→对两者分别进行酶切（选要相同的限制性内切酶对两者进行切割）→酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收→克隆载体和目的基因进行连接（一般选用T4连接酶）→大肠杆菌感受态细胞的制

T载体分两种.一种是末端带有A的典型的T载体,这样的T载体可以与taq酶扩增出来的片段连接,另一种是平末端的T载体,这种T载体末端没有A,它用于以pfu或者是phusion这样的高/超保真酶扩增出来的

原来扩增的时候就有两条带,回收的时候（是凝胶回收吗?）可能因为产物浓度过大,导致两条带没跑开,让你一起切下来了（回收后电泳检测了没?）,所以连接后有两种克隆.至于说为什么会出现两种克隆,要具体问题具体

不管酶切还是PCR,都是间接的结果.要确定克隆的正确,一定要测序的啊.你测个序,问题就迎刃而解了.到底是什么问题也就清楚了.再问：我前些天去遇到一样的问题，酶切鉴定正确，但测序后什么也不是呢再答：所以

二楼正解.不过你的T4ligase浓度是多少?你的insertionDNA和vector浓度又是多少?一般来说商业用T4ligase不会少于20,000u/ml,你的insertionsize又有5k

目的基因和载体比例最好再核对一下,连接时间放久一点试试

用的是T-simple吗?如果不是simple载体,有可能切开的不是你引入的的没切位点,而是载体本身的再问：用的是T-simple啊，发现酶切条带都变大了再答：大了多少？是用的takara的pmd18

你的抗性是氨苄吧,细菌对氨苄的抗性通常是由一种外泌的内酰胺酶来完成的.你培养时间这么长,大肠杆菌分泌的酶已将菌落周围的抗生素降解掉,周围产生卫星菌落就很正常了.

因为在基因工程中,起到载体作用的是大肠杆菌中的质粒,质粒是小分子环状DNA,这才是常用的载体

理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应.但是,以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉,但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）.而以T载体为媒介,

用钙离子处理大肠杆菌,使细胞处于一种容易吸收周围环境中DNA的生理状态（使细胞膜的通透性增加）,这种大肠杆菌成为感受态细胞.

你这个详细的,可以详细成一本书了,我就粗略给你说说哈~先理解个概念,你所说的一个病毒载体是不能进行病毒包装的,病毒包装时还需要多个辅助质粒才行.病毒包装所需要的蛋白等其他关键元件都在辅助质粒上.首先,

现在城市里的自来水,一般大肠杆菌确实都是阴性的.农村里的自来水管道有时候受到污染,可能会检出大肠.

一般来说很难同时连基因和载体相连,首先要用相同的限制性内切酶切割基因和载体,使基因和载体产生相同的黏性末端,才可以使基因和载体相连如果要将两个不同的基因同时连接到一个载体上,那就需要用相同的限制性内切

筛选已完成的重组载体说明大肠杆菌依然存在抗体.是楼主一时被误解.再问：û��

PUC19是个正control,就是一定会出clone的,如果没有,就是操作步骤有问题看你的protocol就是重复做一遍这样的话还不如一起做涂板以后直接放37度啊补充：根据你的说法,从“连接产物”里

启动子有自己的碱基序列会进行识别再问：大侠，如果我插入两个目的基因片段，如何控制他们两个的表达量呢再答：放在特定的培养基中基因的表达是先复制进行转录和翻译所以是由基因本身控制的

完全确保的话,第一,做酶切的两个酶要不一样；二你在做完酶切后,用磷酸化酶处理下,纯化后再连接（这一不会降低连接效率,但会确保质粒不自连.按正确方向克隆

所谓的转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术.在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人