作业帮如何设计条件性基因敲除小鼠模型
来源：学生作业帮 编辑：拍题作业网作业帮 分类：综合作业 时间：2024/04/26 03:25:46
如何设计条件性基因敲除小鼠模型
小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星,成功的小鼠和大鼠模型可谓是生命科学的好帮手.很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠,在此做个小结,供大家参考.
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理.它们都是位点特异性重组酶系统.这里以Cre/LoxP系统为例.比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列,得到flox(flanked by loxP)小鼠.将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖,以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠,即条件性基因敲除小鼠.此外,若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合,还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控.
Cre/loxP系统来源于噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组.该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列),含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列.LoxP的方向由中间这8个碱基决定.这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点.令一个组成部分是Cre重组酶.它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白.Cre可以介导两个LoxP位点的重组,从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失.如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下,可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠,也叫Cre工具小鼠.跟Flox小鼠交配之后,可以得到条件性基因敲除小鼠.
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列.这段序列就是Flanked by LoxP,也就叫做Flox小鼠.这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得.这种小鼠跟Cre工具小鼠交配,由于Cre的表达,介导两个LoxP位点序列的重组,从而敲除两个LoxP之间的序列.由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性,就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标.比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等.
那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计.所谓条件性敲除,是说除了特定细胞外,其它细胞里面没有任何的基因表达异常.一般情况下,不要在第一个外显子前面放置LoxP序列.因为第一个外显子前面一般是启动子.放置LoxP序列有可能会破坏或改变启动子活性.条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子.这样的话,最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子.否则的话,基因可能会利用ORF内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白,这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能.在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧),该外显子的碱基数目不能是3N,否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变.会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白.如果一个外显子的碱基数目是3N+1或3N+2,敲除这个外显子之后会产生移码突变,就可以达到基因敲除的目的.筛选要敲除(Floxed)的外显子的时候,一般是从最上游的外显子开始筛选适合敲除的外显子.需要注意的是,一般的dna分析软件不能确定内含子和外显子的边界,需要仔细核对.95%以上的边界遵循gt/ag边界原则.也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子.这个网站上的结果绝大部分是正确的.但也需要仔细核对.毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程,需要特别小心.前期做多少的考虑都不嫌多.这些原则只是对一般课题的考虑.特殊情况需要特殊处理.
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理.它们都是位点特异性重组酶系统.这里以Cre/LoxP系统为例.比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列,得到flox(flanked by loxP)小鼠.将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖,以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠,即条件性基因敲除小鼠.此外,若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合,还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控.
Cre/loxP系统来源于噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组.该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列),含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列.LoxP的方向由中间这8个碱基决定.这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点.令一个组成部分是Cre重组酶.它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白.Cre可以介导两个LoxP位点的重组,从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失.如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下,可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠,也叫Cre工具小鼠.跟Flox小鼠交配之后,可以得到条件性基因敲除小鼠.
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列.这段序列就是Flanked by LoxP,也就叫做Flox小鼠.这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得.这种小鼠跟Cre工具小鼠交配,由于Cre的表达,介导两个LoxP位点序列的重组,从而敲除两个LoxP之间的序列.由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性,就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标.比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等.
那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计.所谓条件性敲除,是说除了特定细胞外,其它细胞里面没有任何的基因表达异常.一般情况下,不要在第一个外显子前面放置LoxP序列.因为第一个外显子前面一般是启动子.放置LoxP序列有可能会破坏或改变启动子活性.条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子.这样的话,最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子.否则的话,基因可能会利用ORF内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白,这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能.在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧),该外显子的碱基数目不能是3N,否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变.会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白.如果一个外显子的碱基数目是3N+1或3N+2,敲除这个外显子之后会产生移码突变,就可以达到基因敲除的目的.筛选要敲除(Floxed)的外显子的时候,一般是从最上游的外显子开始筛选适合敲除的外显子.需要注意的是,一般的dna分析软件不能确定内含子和外显子的边界,需要仔细核对.95%以上的边界遵循gt/ag边界原则.也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子.这个网站上的结果绝大部分是正确的.但也需要仔细核对.毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程,需要特别小心.前期做多少的考虑都不嫌多.这些原则只是对一般课题的考虑.特殊情况需要特殊处理.