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考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质 用什么作参比? 谢谢!11

来源:学生作业帮 编辑:拍题作业网作业帮 分类:生物作业 时间:2024/03/28 17:38:56
考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质 用什么作参比? 谢谢!11
可溶性蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝法
一、原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种.考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收.其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定.该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法.
二、材料、主要仪器和试剂
1、实验材料:植物叶片.
2、主要仪器
(1)分析天平、台式天平;(2)刻度吸管;(3)具塞试管、试管架;(4)研钵;(5)离心机、离心管;(6)烧杯、量筒;(7)微量取样器;(8)分光光度计.
3、试剂
(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1000μg/mL的原液.
(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL.此溶液在常温下可放置1个月.
(3)乙醇;
(4)磷酸(85%).
四、操作步骤
1、标准曲线制作
(1)0~100μg/mL标准曲线的制作:取6支10mL干净的具塞试管,按表1取样.盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线.
表1 低浓度标准曲线制作
管号 1 2 3 4 5 6
1000μg/mL标准蛋白液(mL) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
蒸馏水(mL) 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90
考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量(μg) 0 20 40 60 80 100
OD595nm
(2)0~1000μg/mL标准曲线的制作:另取6支10mL具塞试管,按表2取样.其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为0~1000μg/mL的标准曲线.
表2 高浓度标准曲线制作
管号 7 8 9 10 11 12
1000μg/mL标准蛋白液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水(mL) 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量(μg) 0 200 400 600 800 1000
OD595nm
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
(1)待测样品制备:称取样品2g放入研钵中,加2mL蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.1h以充分提取,然后在4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液.
(2)测定:另取2支10mL具塞试管,按下表取样.吸取提取液0.1mL(做一重复),放入具塞刻度试管中,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X(μg).以标准曲线1号试管做空白.
表3 待测液蛋白质浓度测定
管号 13 14
蛋白质待测样品提取液(mL) 0.1 0.1
蒸馏水(mL) 0.9 0.9
考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 5 5
OD595nm
蛋白质含量(μg)
五、结果计算
样品蛋白质含量(mg∕g鲜重)=(C×V/a)/W
式中:C为查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg);
V为提取液总体积(ml);
A为测定所取提取液体积(ml);
W为取样量(g).