检测蛋白质的反应有那几个呢?茚三酮反应可以不

检测蛋白质的反应有那几个呢?茚三酮反应可以不

凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）
1.1 原理
凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵.然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量.
2 双缩脲法(Biuret )
2.1 原理
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物.在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应.凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应.紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量.
3 紫外吸收法
3.1 原理
蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280 nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比.此外,蛋白质溶液在238 nm 的光吸收值与肽键含量成正比.利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定.
4 考马斯亮蓝法( Bradford)
4.1 原理
Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.考马斯亮蓝是一种有机染料,在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色,其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm,蛋白质在1～1 000 μg 范围内,蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定.
茚三酮反应：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质.虽然蛋白质和多肽具有茚三酮反应,但是肽链越大,灵敏度越差姑不适合作为定量测定.
再问： 那麻烦你再详细的说说这几个方法的具体操作，可以不？我试着做过双缩脲反应，但是是阴性，不知道是不是我的操作步骤有问题。
再答： 考马斯亮蓝法( Bradford 　2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。 　　 3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。 　　 4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。 　　 5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min． 　　 6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。 要是实验室有紫外分光光度计 也行 我也不知道你的实验步骤问题，不好意思 要是你不能肯定是不是你实验的问题，你可以考虑一下，用蛋白质标准溶液做一下，要是这个也做不出来，可能你的实验存在问题，每一步要仔细一点，