作业帮斑马鱼的内参基因组怎么选择啊?
来源：学生作业帮 编辑：拍题作业网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/04/30 02:17:02
斑马鱼的内参基因组怎么选择啊?
最近我做了荧光定量PCR,每次做的时候溶解曲线效果就很差,不是单一的峰,说明是有非特异性的扩增,但是在普通PCR仪上做的PCR时,只显示了一条带,很清晰,是怎么回事啊?荧光定量的灵敏度太大了么?还有斑马鱼的内参基因怎么选取?做的是相对定量. 答：你说对了,荧光定量的灵敏度太大了.你要明白件事情,EB染色的情况下,在电泳上要形成一个条带的前提是存在5ng的DNA,也就是,如果你的非特异性扩增产物低于5ng的话,你在电泳上是观察不到的,但是SYBR Green染色的情况下,定量PCR可以检测到. 你具体PCR的条件我不是很清楚,但是你可以考虑通过以下几个方面来优化,一个是延长解链时间,保证DNA的充分解链,延长扩增时间,保证扩增的完整性,提高退火温度,减少引物和模板的非特异性结合.此外,你的RNA在反转录前用DNase处理,减少基因组的污染,也有助于提高扩增的特异性. 你如果检测相对表达,最理想的状态,干脆用特异性引物来反转录,事实上,虽然很多人做相对定量都习惯于用随机引物或者是ologo dT来反转录,但是从结果上讲,使用特异引物做反转录最后拿到的结果要更可靠,也更具有特异性.只是反转录的试剂消耗要加倍的,同一个样品你必须单独反转录内参基因和目的基因.如果你要检测其他目的基因,相应消耗更多. 至于内参基因,一般动物细胞的那几个内参基因,Acin,Tubulin, RPL32之类的,最好你能预先检测一下,挑一个最稳定的出来.不要随便用,没有全部通用的内参基因的. ……………… 详细资料请参考：on http://www.bio1000.com/zt/dna/225150.html