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大肠杆菌感受态细胞DNA转化,为什么没有克隆菌生长?

来源:学生作业帮 编辑:拍题作业网作业帮 分类:生物作业 时间:2024/03/29 03:31:40
大肠杆菌感受态细胞DNA转化,为什么没有克隆菌生长?
以下是我的步骤:
猪瘟疫苗216bp片段克隆
1、PMD-18T vector 1ul
216bp胶回收产物 4ul
2、加入5ul的SolutionⅠ
3、16℃连接过夜(大约20h)
感受态细胞的DNA转化:
1.制备好的感受态细胞从—70℃冰箱取出后在冰水混合物中融化10min
2.取100ul感受态细胞,置于1.5ml离心管中.
3.向感受态内加入5ul连接过夜的DNA,轻轻混匀后冰中放置30min.
4.42℃90s,立即入冰中2min.
5.加入1ml37℃的预温营养肉汤.
6.37℃,120r/min,1h培养.(在1.5ml里装着)
7.4000rpm,4℃,离心2min后,取出100ul涂于Amp板上.(Amp是按1/1000的量加入普琼上的).
8.过了18h 都没长.
当然要先用液态不加抗生素的LB复苏好不好.
不要纠结在转化涂板的过程上 要么就是你的质粒酶切完后回收的片段不对 要么就是你的胶回收产物不对
再问: 我用我的胶回收产物重新跑电泳了,条带和Mark亮度差不多的,而且片段就是216bp,没有杂带。 所以不会是胶回收问题。
再答: 那质粒呢 可能切完回收的条带不对 反正应该是没连上的问题 不会是转化的问题 而且只是一次没长出来不是很正常的么